小君 学术策 2024-06-06 12:00 湖南

一、细胞前言

二、细胞类型

根据细胞的来源不同，可分为以下三种类型：

（1）原代细胞：指直接从体内取出或者器官、组织中分离获得的第一代细胞。原代细胞更接近细胞在体内的状态和特性，但获取和培养都比较困难。一般认为，从原代细胞培养第1代至第10代内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下，原代细胞被培养和传代，用于研究细胞的生命周期、细胞癌变、细胞工程等问题。

（2）细胞系：经过原代细胞连续传代成功而形成的细胞系。细胞系指能够连续传代的细胞，称为连续细胞系或无限细胞系；不能连续传代的细胞称为有限细胞系。细胞系由原始培养物中的细胞系谱发展而来。若细胞系无法继续传代或传代次数有限，则为有限细胞系；若能够连续培养并无限传代，则称为连续细胞系。人类肿瘤细胞在体外连续培养半年以上并稳定生长的细胞可称为连续性株或系。

（3）细胞株：通过选择或克隆形成，从原代培养细胞中获得具有特殊性质或标记的细胞。一般认为，细胞株是利用单细胞分离培养或通过筛选方法，由单个细胞增殖而形成的细胞群。细胞株具有特殊性质或标记，这些特性必须在整个培养过程中持续存在。

（1）贴壁细胞：指在培养基表面附着生长的细胞。这类细胞在培养皿内沿着培养基表面贴壁生长，正常细胞形态较好，轮廓清晰，边缘透亮，细胞增殖状况良好。当贴壁细胞生长到密度达到90%时，需要进行传代以维持其正常生长状态。

（2）悬浮细胞：指在培养基中悬浮生长的细胞，不依附于培养皿表面。这类细胞在培养基中均匀分散生长，通常需要使用适当的搅拌或旋转设备来保持细胞的悬浮状态。悬浮细胞适合用于大规模培养和生产。

（3）半贴壁半悬浮细胞：指在培养基中部分附着生长，部分悬浮生长的细胞。这类细胞同时具备贴壁细胞和悬浮细胞的特点，通常在培养基中部分附着生长，部分悬浮于培养基上。对于此类细胞的培养需要综合考虑贴壁和悬浮培养的条件来进行。

（1）操作台环境无菌：在实验操作前，必须对操作台进行紫外线消毒至少30分钟，然后用75%酒精擦拭，确保操作台表面无菌。

（2）实验材料无菌：对实验所需材料进行无菌处理，包括紫外线照射、酒精擦拭、使用酒精灯进行消毒，以及使用封口膜保持材料的无菌状态。

（3）实验时手部无菌：进行实验操作前，必须对双手进行消毒，确保双手无菌状态，避免细菌感染。

（4）实验操作无菌：在实验操作过程中，必须保持操作环境和操作方式无菌，避免细胞培养过程中受到外界细菌的污染。

（1）保持培养箱内温度恒定：在进行细胞培养操作前，要确保培养箱内温度稳定，同时对培养基进行预热，以保持细胞在适宜的环境中生长。

（2）转移细胞时轻拿轻放：在进行细胞转移操作时，要轻柔地操作，避免造成细胞的震动和损伤。

（3）控制细胞在培养箱外的时间：尽量缩短细胞在培养箱外的时间，以维持CO2浓度的稳定，确保细胞在最适宜的环境中生长。

（4）枪头吹打要轻柔：在使用枪头吹打时要注意轻柔操作，避免对细胞造成破坏，保证细胞的健康生长。

（1）基础培养基的成分必须包括氨基酸、维生素、无机盐和缓冲体系，这些成分对细胞的生长和分裂至关重要。

（2）血清在细胞培养中扮演着重要角色，它提供了细胞生长所需的营养物质、生长因子，并促进细胞附着在培养皿表面。常用的血清有胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，常用浓度为5-20%，其中10%是最为常见的。优质血清应该是透明或淡黄色，没有沉淀物和病原体污染。为了减少补体对细胞的毒性，血清通常要在56摄氏度下加热30分钟进行灭活，但这个过程可能会让一些对细胞有益的成分丧失，比如生长因子。

（3）饥饿处理是一种常用的方法，能使细胞停滞在G0期，增加细胞群体的同质性，在药物干预实验中促进细胞对药物的吸收。具体操作为先在含有血清的培养基中培养细胞，使其附着，然后换液为无血清培养基，继续处理6-12小时，开始药物干预。

（4）抗生素的使用需根据实验情况来确定是否需要添加，然而最重要的是要从各个方面都要避免细胞培养的污染，这是非常重要的！

一、细胞复苏

二、细胞传代

（1）在显微镜下观察细胞密度，确保细胞汇合度大于80%，表示细胞已经长得比较密集，可以进行传代了。

（2）在超净工作台上准备好所需的器具，例如移液管、移液枪、T25培养瓶、1ml枪头、PBS溶液等，并经过紫外灯照射和通风消毒。

（3）提前将培养基放在37℃的水浴锅中预热。

（4）使用75%酒精对移液器具、培养瓶等进行消毒。

（5）在培养箱内旋紧培养瓶瓶盖后，取出需要传代的细胞，并在超净工作台上消毒处置。

（6）吸去培养瓶中的上清液。

（7）用5ml的PBS液轻轻润洗细胞，然后吸去PBS。

（8）向培养瓶中加入1ml胰酶，轻轻摇晃使胰酶覆盖细胞层，放入培养箱孵育。

（9）在显微镜下观察细胞解离情况，当细胞明显变圆、细胞间隙增大并呈现流沙状时，停止消化。

（10）加入4ml培养基终止消化，轻轻吹打细胞层表面，使细胞分散成单个细胞。

（11）将细胞悬液收集到50ml离心管中，进行1000-1200r/min的离心，3-5min去除胰酶。

（12）在超净工作台上消毒离心管，吸去上清液，用新鲜培养基重新悬浮细胞。

（13）按照传代比例将细胞悬液分装到新的培养瓶中，补充适量培养基后，摇晃使细胞均匀分布，并标记好。

（14）观察细胞密度和状态，然后将细胞放回培养箱中，旋松瓶盖以确保气体交换畅通。

（1）在润洗细胞时，要轻柔地加入PBS，避免对细胞层造成冲击。

（2）不同细胞的消化时间会有所不同，根据细胞的特性和胰酶的敏感度调整消化时间，可每隔30秒观察一次细胞状态。

（1）在显微镜下观察细胞的状态及密度，确保细胞长得比较密集，可以进行传代。

（2）将移液管、移液枪、T25培养瓶、1ml枪头、PBS溶液等放入超净工作台，经过紫外灯灭菌30分钟后通风30分钟。

（1）从培养箱中取出培养瓶，在超净工作台上轻轻晃动使细胞分布均匀。

（2）使用移液管吸取200ul的细胞悬液进行计数，根据计数结果确定传代的比例。

（3）将细胞分装到新的培养瓶中，加入适量的新鲜培养基，并做好标记。

（4）将培养瓶放回培养箱中，旋松瓶盖以确保充分的气体交换。

（1）将细胞悬液转移至离心管中，以800r/min的速度离心3-5分钟。

（2）吸取上清液。

（3）用1ml预热的培养基重新悬浮细胞沉淀，根据需要将细胞稀释，然后分装到培养瓶中，加入10ml的培养基，并做好标记。

（4）将培养瓶放回培养箱中，旋松瓶盖以确保充分的气体交换。

注意事项：

悬浮细胞需要用未经TC处理的细胞瓶或培养皿培养，如悬浮细胞无碎片，建议按照方法一进行传代。

（1）将细胞悬液倒入50毫升的离心管中，以1000-1200转/分钟的速度离心3-5分钟；

（2）丢弃上清液；

（3）用预冷的（2-8℃）低温冻存液重新悬浮细胞沉淀（建议细胞密度为1×106~1×107个/ml）；

（4）将细胞悬液分装到冻存管中，并标记细胞种类、冻存时间及操作人员。在分装过程中要轻轻混合细胞，以保持均匀的细胞悬浮状态；

（5）将冻存管转移到程序降温盒中，并置于-80℃冰箱中冻存，4小时后或过夜后转移到液氮中（若使用无血清冻存液，则直接放入-80℃冰箱，24小时后转移到液氮长期保存）。

（1）选择处于对数生长期的细胞进行冻存，此时细胞状态较佳；

（2）冻存的细胞不宜长期存储在-80℃环境中，应尽快转移至液氮罐中；

（3）细胞冻存后，应拿出一管进行复苏，并检测细胞的存活率。一般情况下，细胞可以在液氮中长期保存，为了稳妥起见，可在细胞冻存半年后进行复苏培养，观察细胞生长情况后再继续冻存，不同的冻存液冻存方式会有所不同，具体细节请查看说明书。

（1）细胞系培养基的选择非常重要。首先应优先参考细胞来源公司提供的培养条件，并查阅ATCC推荐的相应培养基。不建议随意更换培养基种类，因为不同的细胞株可能已适应特定的培养基，突然更换可能导致细胞形态改变、存活受损或功能丧失。

（2）当细胞发生微生物污染时，应立即处理。可以直接丢弃受影响的培养器皿或培养液，并将未被污染的细胞转移到清洁的培养箱中。同时，使用消毒剂对培养器皿、超净台和二氧化碳培养箱进行彻底消毒。如果发现真菌或霉菌污染，应使用紫外灯照射整个培养箱，以去除可能存在的孢子。另外，需要排除试剂（如培养基和血清）的污染，可以进行空培试验来检测。

（3）培养基在使用一段时间后出现偏紫的情况可能是由于培养液中CO2 溢出导致碱性增加。可以轻轻旋松培养瓶瓶盖，将培养瓶放入二氧化碳培养箱进行校正，一段时间后培养基的颜色会恢复正常。变紫的培养基仍可继续使用，培养细胞时培养箱内的气体会自动调整颜色。

（4）细胞培养液变黄或变浊通常表示细胞密度过高，细胞增殖速度过快，导致酸性代谢产物积聚。此时细胞可能营养不足。如果培养液变浑，可能存在细菌污染。发现这种情况时应及时消化传代处理，以确保细胞的健康生长。

（5）血清中出现的沉淀可以是多种物质的沉淀，包括纤维蛋白、胆固醇、脂肪酸酯和一些蛋白质。其中，纤维蛋白是较大的沉淀物，通常可用肉眼观察到；而磷酸钙也是常见的沉淀物之一，会导致血清浑浊，在37℃培养时增加。这些沉淀物在倒置显微镜下看起来像小黑点，有时会被误认为是微生物污染。这些沉淀物并不会影响细胞的生长，若需要去除沉淀，最好采用离心方法而非过滤方法。

（6）细胞换液的最佳时机是在细胞消化传代后的隔天或隔两天进行一次。如果传代后发现细胞碎片多、死细胞多，但细胞形态已经稳定，可以考虑第二天换液。对于生长速度较慢的细胞，可以在放置足够的培养基的情况下减少换液次数，让细胞静养。如果细胞分布不均匀、堆积、间隙大或在特定区域密度过高，则不需要立即换液，可以采取取消化重铺的方法。

（7）处理细胞支原体污染是一个困难的挑战，支原体易于复发。一般建议直接更换新的细胞株，如果细胞十分重要或昂贵，可以尝试使用四环素、大环内酯类抗生素（如泰乐霉素）或喹诺酮类抗生素进行治疗。

（8）控制胰酶消化时间是非常重要的，不同细胞对消化液的敏感性不同，因此消化时间也会有所不同。一般来说，疏松贴壁的细胞可能需要1-2分钟，正常贴壁的细胞可能需要2-3分钟，而贴壁较牢的细胞可能需要5分钟，贴壁非常牢的细胞可能需要约10分钟。最佳的消化时间是在细胞变圆收缩、细胞间隙变大、轻轻晃动培养瓶即可看到细胞呈流沙状时终止。

（9）避免血清沉淀物的产生有几个关键点：首先，在解冻血清时应按照逐步解冻法操作，避免快速变温；其次，解冻时及使用前需充分摇匀血清，使温度和成分均匀；另外，不要将血清长时间置于37℃下，以免发生变混浊的现象。避免热灭活血清也是很重要的一点，除非必要，不要进行此步骤。

（10）如果对细胞形态有疑问，需要注意以下几点：首先确认细胞所使用的培养基种类是否符合说明书建议，因为改变培养基种类可能会影响细胞形态；其次，可参考引种公司官网细胞照片，也可以查阅ATCC或DSMZ网站的图片；然后，要注意细胞的代次是否过高导致变异，是否有加药诱导或转染等操作；此外，细胞的形态会因密度不同而不同，有些细胞需要一两天才能展开。因此，确保细胞的正常形态需要在细胞密度稳定后确认。