Application of molecular fluorescent probe for detection of active nitrogen in stroke

用于活性氮检测的分子荧光探针在脑卒中的应用

《一》Physicochemical-property guided design of a highly sensitive probe to image nitrosative stress in the pathology of stroke. Chemical Science. Juan Cheng,Dan Li,Meiling Sun,Yi Wang,Qiao-Qin Xu,Xing-Guang Liang,Yun-Bi Lu,Yongzhou Hu,Feng Han and Xin Li. DOI:  10.1039/c9sc03798e

研究背景：

脑卒中(Stroke，即中风)是一种急性大脑局部功能障碍，是目前最危险的疾病之一，死亡率和致残率都很高。尽管最近在治疗和预防方面取得了显著进展，但脑卒中仍然是60岁以上老人的第二大死因。在脑卒中神经损伤和死亡的过程中，氧化和亚硝化应激(Nitrosative Stress)、兴奋性毒性和兴奋性神经损伤起着重要的作用，其中亚硝化应激的损伤作用正引起越来越多研究者的兴趣。据报道，亚硝化应激由大脑局部缺血和随后的大脑中动脉闭塞中过量产生过氧亚硝酸离子(ONOO-)引起，由于其超高的毒性，它正在成为一个有吸引力的分子靶点。

研究内容：

  在这项研究中，利用物理化学特性导向的探针设计策略，结合基于反应的探针设计原理开发了一种超灵敏探针，用于在脑卒中病理中亚硝化应激过程的成像。该探针背景荧光信号几乎为零，但在对亚硝化应激标志物——过氧亚硝酸盐的反应中，

其荧光增强倍数达到1000倍。由于其良好的理化性质，该探针可在静脉给药后迅速穿透血脑屏障，在小鼠大脑中积累，以检测局部血管损伤。在完成成像后，该探针容易降解。这些理想的特征使探针能够直观地显示亚硝化应激在脑卒中病理中的演变过程。

要点：

1. 作者团队根据F4荧光团设计了B545a和B545b两种探针。

2. 作者认为B545b的敏感性较好是由于羟基邻位的甲氧基具有给电子能力，使电子富集于羟基，进而对ONOO-的敏感性更高。因此最终选用B545b进行后续实验。

  3.B545b细胞及小鼠成像。

总结和展望：

  作者在本文中通过理化性质指导开发了一种成像脑卒中期间释放ONOO-的荧光探针B545b。探针本身荧光非常微弱，对内源ONOO-敏感度高。此外，由于B545b具有良好的理化性质，包括较好的脂水分配系数和中等的水溶性，在进行小鼠实验时可以对小鼠进行静脉注射，且易于穿透脑血屏障。这些优势使探针B545b可以对微血管凝块的ONOO-进行示踪，并对大脑局部损伤进行成像。并且，该探针还可以观测到早期局部缺血的大脑软组织过量释放的ONOO-，这些信息对今后抗氧化治疗脑卒中的药物设计有一定的参考价值。

《二》Visualizing Peroxynitrite in Microvessels of the Brain with Stroke Using an Engineered Highly Specific Fluorescent Probe. ACS sensors. Jianhua Xiong, Weiwei Wang, Caixia Wang,Cheng Zhong,Renqiang Ruan,Zhiqiang Mao,Zhihong Liu. DOI: 10.1021/acssensors.0c01555

研究背景：

中风是世界范围内导致死亡和残疾的最主要原因之一。与脑血管中活性氧物质和活性氮物质（ROS / RNS）的功能失调有着密切的联系，过氧亚硝酸盐（ONOO–）是一氧化氮和超氧化物在活生物体中的扩散控制反应所产生的最著名的RNS之一。在生物系统中，过氧亚硝酸盐可氧化和硝化蛋白质酪氨酸残基，硫醇，酶和DNA以及其他生物分子，从而调节细胞氧化还原平衡并支配几种信号转导途径。

研究内容：

通过设计一个吲哚啉-2,3-二酮基团作为识别基团，本文提出了一种新型荧光探针 Rd-PN2，对ONOO−具有高特异性反应，即使在其他高浓度ROS/RNS共存的情况下。Rd-PN2对ONOO−的反应具有较高的灵敏度和反应速度，在追踪活细胞和斑马鱼的内源性ONOO−方面表现出令人满意的性能。因此，Rd-PN2可以在双光显微镜下实时观察缺血性和出血性脑卒中小鼠脑微血管中的ONOO−。这项工作提出了一种精确调制的荧光探针，用于实时可视化脑微血管中ONOO−的产生，这也将有助于在未来对ONOO−功能的研究中获得更准确的信息。

要点：

1. 作者团队设计一个吲哚啉-2,3-二酮基团作为识别基团新型荧光探针 Rd-PN2。

2. Rd-PN2对ONOO−的反应具有较高的灵敏度和反应速度，即使在其他高浓度ROS/RNS共存的情况下。

3. Rd-PN2可以在双光显微镜下实时观察缺血性和出血性脑卒中小鼠脑微血管中的ONOO−。

总结和展望：

本文提出了一种高特异性的ONOO−双光子荧光探针Rd-PN2。Rd-PN2与ONOO−特异性反应，即使在其他高浓度（0.2 mM）的ROS/RNS的共存条件下，也具有>70倍的荧光增强，这允许在缓冲溶液和生物体中准确检测ONOO−。Rd-PN2用于追踪活细胞在对外界刺激的应激反应中内源性ONOO−。它还能够监测LPS诱导的斑马鱼肾损伤中产生的ONOO−。RdPN2的双光子可激发特性，利用TP-CLSM提出了小鼠局部脑微血管的高保真三维重建图像。特别是，该探针被用于在体内观察缺血性和出血性脑卒中小鼠大脑微血管中ONOO−的轮廓。克服了利用光学探针区分ONOO−与其他ROS/RNS的长期困难，这将为研究ONOO−相关的生理和病理事件提供一个有效的新工具。

《三》Simultaneous tracking of autophagy and oxidative stress during stroke with an ICT-TBET integrated ratiometric two-photon platform.Chemical Science.Wei Hu,a Taotao Qiang,Li Chai,Tianyu Liang,Longfang Ren,Fei Cheng,Chunya Li, Tony D. James. DOI: 10.1039/d1sc06805a

主讲人：王惠敏，2024年9月29日

研究背景：

近年来，利用荧光传感技术多目标物同时响应的探针被不断开发用于细胞代谢过程的原位、实时监测。为了避免多目标物同时监测过程中荧光通道的相互干扰，现阶段的探针几乎都缺乏比率的能力，导致其示踪代谢过程的准确性大打折扣，尤其是在代谢发生起点的判断能力明显不足。

研究内容：

本文利用跨键能量转移（TBET）机制设计了粘性和过氧亚硝酸根（ONOO−）双功能线粒体靶向双光子比率探针Mito-ONOO，不仅实现了双发射峰的基线分离，以提高生物成像的分辨率和可靠性，而且首次实现了通过比率分析在OGD/R过程中对自噬和氧化应激的代谢过程进行了实时可视化。研究显示在细胞氧糖剥夺并在进行复氧糖过程细胞随即产生ONOO−并导致细胞氧化应激的发生，在15 min后及有明显的细胞自噬的发生，该结果有潜力为脑卒中的诊断、治疗及药物设计提供新的靶点。

要点：

1. 利用跨键能量转移（TBET）机制设计了粘性和过氧亚硝酰（ONOO−）双功能线粒体靶向双光子比率探针Mito-ONOO-。

2. 通过比率分析在OGD/R过程中对自噬和氧化应激的代谢过程进行了实时可视化。

3. 细胞氧糖剥夺并在进行复氧糖过程细胞随即产生ONOO−并导致细胞氧化应激的发生。

总结和展望：

本工作开发了基于ICT-TBET机理的粘度及ONOO−双功能双光子比率型荧光探针（Mito-ONOO），以实时跟踪OGD/R过程中的自噬和氧化应激。该探针具有高保真成像粘度和ONOO−，线粒体靶向能力，双发射峰的基线分离，可在活细胞和体内以高分辨率和可靠性实现对自噬和氧化应激的实时原位追踪。据文献报到，Mito-ONOO是第一个通过比率分析实现OGD/R过程中自噬和氧化应激实时可视化的探针。研究显示在细胞氧糖剥夺并在进行复氧糖过程细胞随即产生ONOO−并导致细胞氧化应激的发生，在15 min后及有明显的细胞自噬的发生，该结果有潜力为脑卒中的诊断、治疗及药物设计提供新的靶点。